PRODUÇÃO DE EXOPOLISSACARÍDEOS POR Leuconostoc mesenteroides EM UMA BEBIDA LÁCTEA FERMENTADA COM AVEIA

DOI: 10.53934/agronfy-2025-04-09

ISBN: 978-65-85062-25-1

Este capítulo faz parte da coletânea de trabalhos apresentados no II CONGRESSO PARAIBANO DE PROCESSAMENTO E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS – Acesse ele aqui.

Sigali, SILVANA¹; Ramson, JOICE¹; Siqueira, MARIA FERNANDA¹; Fiorentini, ÂNGELA MARIA¹

¹Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Pelotas

E-mail para correspondência: silvanasigali@gmail.com

Resumo gráfico

Introdução

As bactérias ácido-láticas (BAL) constituem um grupo heterogêneo de microrganismos que sintetizam ácido lático como principal subproduto da metabolização de carboidratos e, por isso, são amplamente utilizadas na produção de alimentos fermentados (Ayivi et al. 2020). Esses microrganismos apresentam características típicas de bactérias Gram-positivas, catalase-negativas, não formam esporos, toleram ambientes ácidos e podem ser anaeróbias, aeróbias facultativas ou microaerófilas (Wang et al. 2021; Werning et al. 2022). Durante a fermentação, as BAL produzem ácidos orgânicos e sintetizam compostos bioativos como aminoácidos, bacteriocinas e biopolímeros, além de enzimas glicolíticas, lipolíticas e proteolíticas (Joshi et al., 2024; García-Cano et al., 2020, Bisson et al., 2024).

Dentre os metabólitos sintetizados por BAL, os exopolissacarídeos (EPS) têm chamado atenção devido às suas propriedades com funcionalidade tecnológica como emulsificação, viscosidade e estabilidade (Liang et al. 2024). Esses biopolímeros são formados por longas cadeias de monossacarídeos e podem ser classificados como homopolissacarídeos (compostos por um único tipo de monossacarídeo) ou heteropolissacarídeos (compostos por dois ou mais tipos de monossacarídeos em diferentes proporções) (Diez-Ozaeta & Astiazaram, 2022; Daba et al. 2021).

Os exopolissacarídeos (EPS) sintetizados por bactérias ácido-láticas (BAL) desempenham papéis essenciais no aprimoramento das características funcionais de alimentos e materiais, atendendo às demandas da indústria moderna. A aplicação tem ganhado destaque devido à versatilidade e aos benefícios tecnológicos e de segurança alimentar que oferecem. Os EPS produzidos por BAL apresentam a capacidade de reter umidade em alimentos, modificar sua reologia, aumentando a firmeza e alterando suas propriedades biomecânicas (Kaur & Dey, 2023). Além disso, também demonstram propriedades antimicrobianas e antioxidantes, especialmente quando utilizados em materiais de embalagem, onde em um estudo conduzido por Jenab et al. (2017), o EPS produzido foi capaz de inibir a multiplicação de Rhizoctonia, Pseudomonas sp. e Staphylococcus aureus.

Com o crescente interesse por alternativas naturais e sustentáveis, os exopolissacarídeos (EPS) têm se destacado como componentes promissores na indústria alimentícia e de embalagens. Os EPS produzidos durante o processo fermentativo atendem à demanda do consumidor por aditivos mais saudáveis e diminuição do teor de gorduras de derivados lácteos sem alterar o aroma, textura e sabor característicos (Daba, Elhanas & Elkhateeb, 2021). Desse modo, os EPS possuem vantagens em relação aos polímeros sintéticos devido à sua origem natural, que os torna biodegradáveis, ao contrário dos polímeros derivados do petróleo, que podem permanecer no ambiente por longos períodos (Mouro, Gomes & Gouveia, 2024).

Entre as BAL produtoras de EPS, a espécie Leuconostoc mesenteroides se destaca (Lule et al. 2016), principalmente na produção de EPS homopolissacarídeos do tipo dextrana (Baek et al. 2024), utilizando glicose, frutose e sacarose como fontes de energia (Miyamoto et al. 2023). A dextrana é incolor, inodora e insípida e quimicamente inerte, o que a torna compatível com diversos ingredientes alimentícios (Dahiya & Nigam, 2023). Esse metabólito é frequentemente aplicado na indústria de laticínios para espessar leites fermentados (de Paula et al. 2015). A produção in situ de EPS contribui para a melhoria da textura dos alimentos, aprimorando as propriedades sensoriais, como sabor, brilho e cremosidade, além de reduzir a sinérese durante o armazenamento refrigerado (London et al. 2015).

Uma matriz que tem se mostrado eficaz para a multiplicação de L. mesenteroides é a aveia, a qual é rica em oligossacarídeos, peptídeos e aminoácidos essenciais (Yu et al. 2023). Além de favorecer a multiplicação das BAL, a utilização da aveia em produtos alimentícios proporciona benefícios à saúde do consumidor (Decker, Rose & Stewart, 2014). Esse cereal contém β-glucanas, fibras dietéticas solúveis em água que, quando consumidas em quantidades iguais ou superiores a 3 g por dia, auxiliam na redução do colesterol total e do LDL (lipoproteínas de baixa densidade) (Whitehead et al. 2014; Tang et al. 2022). As β-glucanas também apresentam atividade prebiótica, contribuindo para a saúde intestinal ao estimular a multiplicação das BAL e beneficiar a microbiota intestinal (Ziarno & Cichońska, 2021).

A aveia tem se destacado como uma matriz promissora no desenvolvimento de bebidas fermentadas, graças à sua composição nutricional rica em fibras, especialmente β-glucanas, e compostos bioativos que oferecem diversos benefícios à saúde. Além de estimular a multiplicação de bactérias ácido-láticas, a incorporação da aveia enriquece os produtos com valor funcional. Diante disso, este estudo teve como objetivo avaliar a influência da temperatura de fermentação na síntese de EPS pela bactéria ácido-lática Leuconostoc mesenteroides KLM6, isolada de kefir, em uma bebida láctea fermentada contendo extrato hidrossolúvel de aveia.

Metodologia

2.1 Microrganismo

Foi utilizada como cultura fermentadora a espécie Leuconostoc mesenteroides KLM6 – isolada de kefir, caracterizada e identificada molecularmente, com código de acesso NZ_CP028251.1 no GenBank (Bierhals, 2024).

2.2 Produção da bebida láctea fermentada

A bebida láctea foi preparada utilizando 100 mL de uma formulação adaptada da metodologia de Klajn et al. (2021). Primeiramente, foi produzido o extrato de aveia, utilizando 20 g de farelo de aveia (Mundo Integral®) imerso em 30 mL de água por 60 minutos. Os flocos foram lavados em água corrente para remover o amido e processados com 30 mL de água gelada (∼8 °C) por 2 minutos, sendo depois coados em tecido tipo voil.

Para a bebida láctea, foram misturados 40% de leite em pó reconstituído (Piracanjuba®), 30% de soro de leite reconstituído (BRF®), 30% de extrato de aveia e 10% de sacarose (Caravela®). A mistura foi tratada termicamente em banho-maria (90 °C/5 minutos), resfriada a 42 °C e inoculada com 1 mL da cultura de L. mesenteroides KLM6 (10,78 ± 0,82 log UFC/mL). Foram produzidas três bebidas fermentadas a 38 °C, 42 °C e 50 °C em iogurteira doméstica (Izumi®, Brasil) por 6 horas, sem controle de pH.

2.3 Extração de exopolissacarídeos

A extração do EPS produzido por L. mesenteroides KLM6 foi realizada conforme Dabour et al. (2005), com modificações de Ali et al. (2020) e Lima et al. (2008). A amostra foi aquecida a 100 °C por 30 minutos para inativar enzimas e liberar o EPS aderido às células. As células foram removidas por centrifugação a 5.000 g, 4 °C, por 20 minutos. O sobrenadante foi tratado com ácido tricloroacético (80%) na proporção de 1:6 e mantido a 4 °C por 60 minutos para precipitação de proteínas.

Após centrifugação a 7.000 g, 20 °C, por 35 minutos, etanol P.A. foi adicionado ao sobrenadante na proporção de 1:2, com repouso a 4 °C por 24 horas. O EPS precipitado foi obtido por centrifugação a 7.000 g, 4 °C, por 20 minutos. O precipitado foi ressuspendido em 10 mL de água destilada e submetido à diálise em membrana de 3.500 kDa (Serva®, Alemanha) sob agitação por 48 horas a 4 °C, para eliminar resíduos do ácido tricloroacético, sais e açúcares de baixo peso molecular.

2.4 Quantificação de exopolissacarídeos

Após as 48 h da etapa de diálise, o conteúdo da membrana foi recolhido e quantificado através da metodologia do fenol-ácido sulfúrico (Dubois et al. 1956). Em um tubo falcon, o conteúdo da membrana foi homogeneizado com uma solução de fenol 5% (1:0,25) e ácido sulfúrico (1:1,25). O tubo foi mantido em repouso por 10 min e em seguida agitados em vórtex por 30 s.

 Após a agitação, os tubos foram levados a banho-maria a 25 °C por 20 min e em seguida foram aliquotados em placas de 96 poços e as leituras realizadas em espectrofotômetro de placas (EZ Read 400 Biochrom, Estados Unidos da América) em um comprimento de onda de 492 nm, em triplicata. Os resultados foram obtidos através da curva padrão de glicose.

Os dados coletados foram submetidos a análise estatística para verificar a significância das diferenças observadas entre as amostras. A análise de variância (ANOVA) foi aplicada, seguida pelo teste de Tukey para comparação das médias, considerando um nível de significância de p < 0,05. Todos os cálculos estatísticos foram realizados com o auxílio do software GraphPad 8.1, garantindo exatidão na interpretação dos resultados.

3. Resultados e discussão

A produção de exopolissacarídeos (EPS) por Leuconostoc mesenteroides KLM6 nas temperaturas de 38 °C, 42 °C e 50 °C está apresentada na Tabela 1. Os valores obtidos revelam diferenças na eficiência da síntese de EPS em função da temperatura de fermentação, com destaque para os resultados de 38 °C e 50 °C, que apresentaram produções significativamente superiores em comparação a 42 °C.

Tabela 1 – Produção de exopolissacarídeos por Leuconostoc mesenteroides KLM6 em uma bebida láctea fermentada com extrato de aveia nas temperaturas de 38 °C, 42 °C e 50 °C.

Valores expressos em média e desvio padrão, das triplicatas.

Letras diferentes indicam diferença significativa entre os valores.

Fonte: A autora, 2024.

Os resultados indicam que, para as temperaturas de 38 °C e 50 °C, não houve diferença estatística significativa na produção de EPS, com valores de 85,19 mg/L e 87,14 mg/L, respectivamente. Em contrapartida, a fermentação a 42 °C resultou na menor produção de EPS (35,0 mg/L), sugerindo que esta temperatura não favoreceu a atividade metabólica de L. mesenteroides KLM6 para a síntese de exopolissacarídeos.

Essa redução pode estar associada a uma atividade enzimática subótima ou a alterações na dinâmica do metabolismo celular em condições de temperatura intermediária. Por outro lado, os resultados obtidos para 38 °C e 50 °C indicam que essas temperaturas oferecem condições mais favoráveis para a produção de EPS, seja pela maior eficiência na conversão dos substratos disponíveis ou pela estabilidade dos sistemas enzimáticos responsáveis pela síntese dos biopolímeros.

Esses resultados reforçam que a temperatura de fermentação é um fator determinante para a produção de EPS, influenciando diretamente a quantidade e qualidade dos compostos obtidos.

Lule et al. (2015) avaliaram a produção de EPS por duas cepas de L. mesenteroides utilizando soro de leite como substrato. As amostras de soro de leite, enriquecidas com 10% de sacarose, 0,1% de extrato de levedura e fosfato de potássio dibásico, foram obtidas a partir da fabricação de queijo paneer e de queijo tradicional. A cepa L. mesenteroides NCDC 744, fermentada a 30 °C por 18 horas, produziu 12,7 ± 0,24 mg/L de EPS no soro de paneer e 11,6 ± 0,27 mg/L no soro de queijo. Já a cepa L. mesenteroides NCDC 745 apresentou valores semelhantes, com 10,51 ± 0,18 mg/L no soro de paneer e 9,40 ± 0,19 mg/L no soro de queijo.

Os resultados obtidos na produção de EPS por Lule et al. (2015) foram significativamente inferiores aos observados neste estudo, o que evidencia que, mesmo com a suplementação do meio com fontes de carbono simples, como sacarose e extrato de levedura, essas condições não foram suficientes para alcançar uma maior produção de EPS. Isso ressalta a importância de combinar substratos mais complexos, como o extrato hidrossolúvel de aveia, que oferece uma matriz rica em nutrientes e açúcares disponíveis, promovendo um ambiente mais favorável para a síntese otimizada de exopolissacarídeos.

Em outro estudo, a fermentação de soro de leite suplementado com lactose, glicose e sacarose a 30 °C por 48 horas resultou na produção de 12,136 mg/mL de EPS bruto pela cepa L. mesenteroides XR1 (Wang et al. 2021). Esse desempenho pode ser atribuído à suplementação do meio com glicose, conforme sugerido por Midik et al. (2020), que destacam a capacidade desse carboidrato de potencializar a síntese de exopolissacarídeos ao fornecer uma fonte de energia facilmente metabolizável pela bactéria.

Angelin e Kavitha (2020) destacam que a produção máxima de EPS é geralmente alcançada ao final da fase exponencial de crescimento. Essa observação é corroborada por Baek et al. (2024), que investigaram a cepa L. mesenteroides J18 utilizando diferentes fontes de carbono. Em seus experimentos, a fase estacionária foi atingida após cerca de 10 horas de fermentação a 30 °C em meio suplementado com sacarose, enquanto no meio com glicose esse período foi estendido para aproximadamente 20 horas.

Esses dados ajudam a explicar os resultados do presente estudo, considerando que o farelo de aveia oferece uma matriz rica em açúcares, como sacarose, rafinose, maltose e glicose (MacArthur & D’Appolonia, 1979), que podem ser facilmente metabolizados por L. mesenteroides KLM6, favorecendo a produção de exopolissacarídeos.

3. Conclusão

A fermentação conduzida a 50 °C apresentou a maior concentração de exopolissacarídeos (EPS), destacando-se como a condição mais eficiente entre as temperaturas avaliadas. Essa temperatura não apenas maximizou a produção de EPS por Leuconostoc mesenteroides KLM6, mas também mostrou atender plenamente às exigências sensoriais e reológicas necessárias para o desenvolvimento de uma bebida láctea fermentada de qualidade superior. Os resultados obtidos sugerem que a temperatura de 50 °C favorece a atividade metabólica da cepa, otimizando a síntese de EPS e proporcionando melhorias significativas na textura, cremosidade e estabilidade do produto final.

Além disso, a matriz de extrato hidrossolúvel de aveia utilizada no estudo demonstrou ser uma excelente base para a multiplicação de L. mesenteroides KLM6, oferecendo nutrientes e açúcares essenciais para a produção de EPS. Essa combinação entre substrato e condições de fermentação reforça o potencial de inovação no desenvolvimento de bebidas fermentadas funcionais, alinhadas às tendências de consumo por alimentos saudáveis, sustentáveis e com benefícios tecnológicos.

Portanto, este estudo contribui para o avanço no entendimento dos fatores que influenciam a produção de EPS e sua aplicação na indústria alimentícia. Estudos futuros poderão explorar outras variáveis, como tempo de fermentação, diferentes fontes de carbono e combinações de matrizes, ampliando ainda mais o conhecimento sobre as condições ideais para maximizar a eficiência produtiva e as propriedades funcionais dos exopolissacarídeos.

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