ADAPTAÇÃO CRUZADA DE Cronobacter sakazakii AO CINAMALDEÍDO SOB ESTRESSE ÁCIDO

Este capítulo faz parte da coletânea de trabalhos apresentados na VII Semana de Alimentos (Semal), publicado no livro: Avanços e Pesquisas em Ciência dos Alimentos: Novas Tendências e Aplicações. – Acesse ele aqui.

DOI: 10.53934/agronfy-2025-03-24

ISBN:

Michelle Carlota Gonçalves1 *; Monique Suela Silva2 ; Mônica Aparecida da Silva1 ; Bruna Azevedo Balduino1 ; Anderson Henrique Venâncio1 ; Tenille Ribeiro de Souza3 ; Jessica Raquel Sales Carvalho de Souza1 ; Fernanda Pereira1 ; Juliana Junqueira Pinelli4 ; Roberta Hildorf Piccoli

*Autor correspondente (Corresponding author) –Email: michellecienciasdealimentos@gmail.com;

RESUMO

Controlar o crescimento microbiano na indústria de alimentos é crucial. Entretanto, observa-se aumento da tolerância dos microrganismos aos sanificantes mais empregados, exigindo-se a necessidade de estudos com novos antimicrobianos. Assim, o trabalho objetivou verificar a ocorrência de adaptação cruzada de Cronobater sakazakii ao composto majoritário cinamaldeído quando submetido previamente a estresse ácido. Para isso, foi determinada a concentração mínima bactericida (CMB) da bactéria ao cinamaldeído bem como o pH mínimo de crescimento. A faixa de pH dos testes variou de 3,5 a 7,0 e dosagens de cinamaldeído entre 0,015 a 2,0%. A CMB de cinamaldeído para C. sakazakii empregada nos testes posteriores foi 0,125% e o pH mínimo de crescimento foi 4,5. Após a exposição de células ao pH mínimo de crescimento (4,5) e posteriores testes em diferentes concentrações de cinamaldeído (0,5 CMB; 1CMB; 1,2CMB; 1,4CMB; 1,6CMB; 1,8CMB e 2CMB), as células de C. sakazakii apresentaram a capacidade de adaptação cruzada por crescerem em concentrações de até 2CMB. Os resultados reforçam que o cinamaldeído pode ser utilizado para elaboração de sanificante para controle de C. sakazakii, utilizando concentrações corretas, evitando o aparecimento de tolerância, bem como da adaptação cruzada.

Palavras-chave: agentes estressores; aumento de tolerância bacteriana; sanificante alternativo;

INTRODUÇÃO

Cronobacter sakazakii é uma bactéria que se destaca como contaminante de fórmulas infantis, podendo levar à morte de recém-nascidos. Devido ao seu impacto nas Unidades de Terapia Intensiva Neonatal, a Organização Mundial da Saúde (OMS) e a Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO) recomendaram medidas de controle globais (1). Embora seja mais conhecida por afetar neonatos, C. sakazakii pode causar infecções diversas em pacientes de diferentes faixas etárias e condições, incluindo bebês, imunossuprimidos e idosos, gerando sintomas como sepse, meningite grave, convulsões, abscessos cerebrais, infarto, hidrocefalia e outrascomplicações neurológicas (2). Por ser uma bactéria ubíqua, encontrada em diferentes ambientes e alimentos, como vegetais, carnes, queijos e leite (3), seu controle ganha importância.

Uma forma comum de controle de microrganismos na indústria alimentícia é o uso de sanificantes. Entretanto, a aplicação contínua desses produtos e a presença de outras condições estressantes nos ambientes de processamento podem levar ao surgimento de bactérias tolerantes (ou adaptadas), persistentes e/ou resistentes (4), dificultando o controle. Outro ponto importante é que a maioria das bactérias forma biofilmes, o que aumenta sua tolerância a agentes estressores usados no processamento de alimentos (5). Nesses cenários, é comum observar adaptações fisiológicas que conferem maior resistência ao estressor aplicado, seja ele o mesmo (adaptação homóloga) ou outro diferente (adaptação heteróloga) (6).

Dado o potencial adaptativo das bactérias ao estresse causado por sanificantes ou outros agentes, estudos que investigam antimicrobianos alternativos, como óleos essenciais, têm ganhado destaque. Por serem compostos complexos, contendo de 20 a 60 componentes em proporções variáveis (7), os óleos essenciais têm mecanismos de ação diversos contra células bacterianas. Eles podem interferir na membrana citoplasmática, na força próton-motriz, no DNA, na parede celular, na produção de ATP, na síntese proteica, no citoplasma e no sistema de quorum sensing (8,9), dificultando a recuperação celular e reduzindo a adaptação homóloga e heteróloga.

A bactéria C. sakazakii é capaz de se adaptar homóloga e heterologamente a diversos estressores, além de formar biofilmes em diferentes superfícies. Relatos indicam adaptações homólogas ao estresse térmico (10) e a antimicrobianos como biguanidina polihexametileno e triclosan (11), além de adaptações heterólogas a ácidos orgânicos (12), quaternário de amônio e cloro (13). Também foi observado aumento da tolerância ao estresse oxidativo, associado à maior virulência (14).

A adaptação homóloga e heteróloga de bactérias a óleos essenciais ou seus compostos majoritários depende da cepa avaliada. Por isso, é essencial realizar estudos com várias cepas de diferentes espécies para avaliar a real segurança do uso desses antimicrobianos naturais. Apesar de existirem estudos sobre a resposta adaptativa de bactérias a óleos essenciais, não foram encontrados trabalhos específicos com C. sakazakii. Ainda, há poucos estudos disponíveis sobre o uso de óleos essenciais no controle dessa bactéria e sua capacidade de desenvolver adaptações homólogas e heterólogas a esses compostos. Assim, o trabalho objetivou verificar a ocorrência de adaptação cruzada de Cronobater sakazakii ao composto majoritário cinamaldeído quando submetido previamente a estresse ácido.

MATERIAL E MÉTODOS

LOCAL DO EXPERIMENTO

As análises microbiológicas foram realizadas no Laboratório de Microbiologiade Alimentos localizado no Departamento de Ciência dos Alimentos da Universidade Federal de Lavras.

MICRORGANISMO PADRÃO, PADRONIZAÇÃO E PREPARO DO INÓCULO

Cronobacter sakazakii INCQS 00115 foi obtido na Coleção de Bactérias de Referência em Vigilância Sanitária, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,Brasil). A cultura estoque foi armazenada em meio de congelamento. A reativação da cultura foi em caldo Brain Heart Infusion (BHI) a 37 ºC/-24 h. A padronização, em 108 UFC/mL, foi realizada por curva de crescimento, com acompanhamento da densidade ótica (D.O.) 600 nm em espectrofotômetro (SP-2000®, Bell, Piracicaba, São Paulo, Brazil) em Caldo de Triptona de Soja (TSB) e a contagem em placa em meio Ágar Triptona de Soja (TSA), ambos incubados a 37 °C/ 24 h.

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MÍNIMA BACTERICIDA (CMB) DE CINAMALDEÍDO

A concentração mínima bactericida do componente majoritário foi determinada empregando-se a técnica de microdiluição em caldo, em placa de poliestireno de 96 cavidades, de acordo com o NCCLS (M7-A6) com adaptações. O componente majoritário cinamaldeído foi solubilizado em caldo BHI acrescido de Tween 80 (0,5%) para serem preparadas as seguintes concentrações (%): 2,0; 1,0; 0,5; 0,25; 0,125; 0,062; 0,031 e 0,015 (v/v). Alíquotas de 150 µL das soluções foram adicionadas nas cavidades e inoculados 10 µL da cultura de C. sakazakii padronizada. A microplaca foi vedada e incubada a 37 ºC/ 24 h. Após esse período, foi realizado o plaqueamento de alíquotas da cultura em TSA e incubado a 37 °C/24 h. A concentração mínima bactericida do componente foi aquela onde, após incubação, não ocorreu crescimento bacteriano em placa. O experimento ocorreu em triplicata, três repetições e dois controles: controle negativo, contendo apenas BHI acrescido de 0,5% de Tween 80 e componente majoritário; e controle positivo, contendo BHI acrescido de 0,5% de Tween 80 e inóculo.

DETERMINAÇÃO DO pH MÍNIMO DE CRESCIMENTO

As células de C. sakazakii foram submetidas a pH de 3,5 a 7,0 e o menor valor de crescimento bacteriano observado foi considerado o pH mínimo de crescimento. As doses subletais utilizadas com base nas CMB e foram equivalentes a CMB/4, CMB/8 e CMB/16 com adaptações. Em tubos tipo Falcon contendo 36 mL de caldo BHI acrescido de 0,5% de Tween 80 foi adicionado o componente nas concentrações subletais. Após homogeneização, alíquotas de 4 mL de inóculo padronizado foi adicionado ao meio e os tubos foram incubados a 37 ºC/6 h. Após esse período asculturas foram centrifugadas a 5000 x g por 5 min e as células recuperadas foram lavadas três vezes com solução salina e utilizadas.

AVALIAÇÃO DA ADAPTAÇÃO CRUZADA DE C. sakazakii AO CINAMALDEÍDO

Em tubos tipo Falcon contendo 9 mL de caldo BHI em pH mínimo de crescimento de C. sakazakii, ajustado com ácido lático (98%), foram inoculados 1 mL de inóculo padronizado e incubados a 37ºC/6h. Após esse período, as culturas foram centrifugadas (5000 x g/5 min) e as células adaptadas foram lavadas três vezes com solução salina e utilizadas.

As células expostas ao pH mínimo de crescimento foram ressuspendidas em caldo BHI e a cultura foi padronizada em 108 UFC/mL para posterior exposição às diferentes concentrações de cinamaldeído (CMB/2; CMB; 1,2CMB; 1,4CMB; 1,6CMB; 1,8CMB e 2CMB). O ensaio foi realizado em microplacas de poliestireno de 96 poços e incubadas a 37 ºC/24 h. Após esse período, alíquotas de 10 μL foram retiradas dos poços e plaqueadas em TSA pelo método de microgotas e encubadas a 37 ºC/24 h.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados das determinações da concentração mínima bactericida de cinamaldeído e pH mínimo de crescimento sobre C. sakazakii estão indicados nas Tabela 1 e 2 respectivamente.

O resultado apresentado na Tabela 1 evidencia a eficiência do antibacteriano cinamaldeído pela baixa concentração mínima bactericida sobre C. sakazakii (0,125%).

Os óleos essenciais demonstram comprovada atividade antimicrobiana contra uma ampla variedade de bactérias, incluindo as causadoras de toxinfecções alimentares e deterioração, tanto Gram-positivas quanto Gram-negativas (7,15,16). Sua aplicação tem sido recomendada como sanificante, conservante em alimentos ou como complemento terapêutico em combinação com antibióticos. Contudo, há uma carência de estudos voltados especificamente para sua eficácia contra C. sakazakii. A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais é atribuída principalmente aos seus componentes principais, embora os seus componentes vestigiais possam contribuir significativamente para a sua atividade antimicrobiana.

A Tabela 2 apresenta o pH de 4,5 como mínimo de crescimento para C. sakazakii. A avaliação da adaptação cruzada ao cinamaldeído sob estresse ácido a partir do pH mínimo de crescimento demonstrou que C. sakazakii foi capaz de suportar todas as concentrações superiores às CMB. Adaptação microbiana pode ocorrer em ambiente industrial com relativa facilidade devido a prática habitual de diluição de agentes e sanitizantes para fins de maior rendimento econômico, portanto, os manipuladores de alimentos devem adotar práticas criteriosas a respeito do controle desenvolvimento de resistência dos microrganismos patogênicos.

A capacidade bacteriana de adaptação homóloga e heteróloga a condições transitórias é bem conhecida, particularmente no que diz respeito à oxidação, condições ácidas, stress térmico, altas pressões, antibióticos e agentes sanitizantes. No entanto,pouco se sabe sobre a capacidade de adaptação das bactérias de origem alimentar aos óleos essenciais. Neste trabalho, a estirpe de C. sakazakii analisada desenvolveu uma adaptação homóloga e heteróloga ao cinamaldeído.

Uma das principais estratégias das células ao enfrentarem estresse químico é modificar a composição de suas membranas, visando torná-las menos permeáveis ao agente estressor. Essas alterações envolvem mudanças na composição dos ácidos graxos e das porinas na membrana externa (17). Estudos mostram que doses subletais de óleo de orégano ou carvacrol causaram injúrias subletais em Salmonella Typhimurium ATCC 14028, resultando em maior síntese de ácidos graxos insaturados e isomerização cis-trans na membrana (18). Já a adaptação de Salmonella Thompson ao timol levou ao acúmulo de proteínas de membrana externa com dobramento incorreto (19) e à upregulação das proteínas OmpX e OmpA, relacionadas à membrana externa (20).

Os ácidos fracos afetam a capacidade celular de manter a homeostase do pH, interrompendo o transporte de substratos e inibindo as vias metabólicas (21). No entanto, sabe-se que C. sakazakii é capaz de desenvolver tolerância a valores de pH ácidos, crescendo mesmo em ambientes de pH 3,5 (22), em consonância com os resultados do presente trabalho.

Observou-se nesse estudo, a adaptação heteróloga pelo aumento da tolerância da bactéria ao cinamaldeído e posteriormente ao ácido lático, por crescer em concentrações antes consideradas letais. Isto pode ter ocorrido devido à ação simultânea dos óleos essenciais e do ácido lático sobre alvos semelhantes dentro da célula, nomeadamente, sobre mecanismos fisiológicos comuns que levam à morte celular, ou devido a vias de acesso comuns aos seus respectivos alvos (23). Juven et al. (24) afirmam que as propriedades antibacterianas de alguns componentes de óleos essenciais podem ser melhoradas após a exposição a baixos valores de pH. No entanto, neste estudo, este comportamento não foi observado. Com base no conceito de adaptação heteróloga, observou-se o desenvolvimento de tolerância cruzada para C. sakazakii quando previamente exposta a pH subletais e ambientes ricos em óleos essenciais.

Investigar a capacidade de adaptação ao estresse relacionada aos óleos essenciais é fundamental, pois o sistema de resposta ao estresse celular é altamente interligado. A exposição a um agente estressor específico pode induzir maior tolerância a diferentes estressores, incluindo variações de temperatura, alterações de pH, antibióticos e outros óleos essenciais.

CONCLUSÕES

Componentes majoritários de óleos essenciais, como o cinamaldeído, são apontados como alternativa promissora aos sanitizantes comuns utilizados na indústria de alimentos. Os agentes de natureza química de alta acidez quando administrados de forma incorreta podem ocasionar problemas de impacto significante sobre a saúde humana, bem como drásticas consequências econômicas.

Neste estudo, foi evidenciado que células de C. sakazakii submetidas a estresse ácido tornam-se adaptadas a concentrações até duas vezes maiores que as definidas como mínimas bactericidas. Assim, torna-se clara a importância do uso criterioso de sanitizantes na indústria de alimentos a fim de evitar a adaptação cruzada de cepas patogênicas.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem á FAPEMIG, CAPES e CNPQ pelo suporte financeiro no desenvolvimento da pesquisa.

REFERÊNCIAS

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