AVALIAÇÃO DE PADRÕES MICROBIOLÓGICOS DE QUEIJOSMINAS ARTESANAIS DA MICRORREGIÃO DO CAMPO DASVERTENTES

Este capítulo faz parte da coletânea de trabalhos apresentados na VII Semana de Alimentos (Semal), publicado no livro: Avanços e Pesquisas em Ciência dos Alimentos: Novas Tendências e Aplicações. – Acesse ele aqui.

DOI: 10.53934/agronfy-2025-03-34

ISBN:

Mônica Aparecida da Silva *1; Anderson Henrique Venâncio 1; Bruna Azevedo Balduíno 1; Monique Suela Silva 2; Michelle Carlota Gonçalves 1; Fernanda Pereira 1; Jessica Raquel Sales Carvalho de Souza 1; Roberta Hilsdorf Piccoli

*Autor correspondente (Corresponding author) –Email: mondiga25@gmail.com

RESUMO

O Queijo Minas Artesanal (QMA) possui um modo de fazer tradicional. Em muitas microrregiões, é a base de subsistência do agronegócio familiar e a falta de conhecimento e treinamentos do produtor, pode induzir a produção com possíveis falhas higiênicas. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi analisar amostras de queijos frescos e maturados de dois produtores da região do Campo das Vertentes, em relação a presença de estafilococos coagulase positivo, conforme parâmetros estabelecidos pela legislação vigente, ambos os queijos analisados em distinção ao centro e a casca da sua massa, em duas datas, sendo no período do verão e no período do inverno, de 2023. Alíquotas do QMA foram homogeneizados em solução conforme metodologia específica e seguiram para análise microbiológica e teste de coagulase, para confirmação da identificação dos microrganismos. Esses isolados foram também identificados por MALDI-TOF MS. Os queijos maturados do produtor G, no inverno, e do produtor M no verão, nas regiões centrais, apresentaram contagem acima do estabelecido pela legislação, 1,4 x103 e 3,5 x103 UFC/g, respectivamente, sem diferença significativa entre produtores ou em virtude da sazonalidade. Staphylococcus aureus foram confirmados nas amostras de queijos frescos e maturados pela técnica de identificação do perfil proteico, MALDI-TOF MS, mostrando a importância da combinação entre técnicas dependentes e independentes de cultivo, para confirmação da segurança de produtos. A origem da contaminação pode ser por falta de higiene dos manipuladores ou como agente etiológico da mastite clínica, demandando acompanhamento do rebanho e boas práticas de fabricação.

Palavras-chave: contaminação microbiológica; estafilococos coagulase positivo; produção artesanal; segurança de alimentos

INTRODUÇÃO

Da produção queijeira do Brasil, o Queijo Minas Artesanal (QMA) destaca-se como um dos melhores e mais tradicionais (1). Talvez, por isso, a grande relevância naprodução de queijos artesanais a partir do leite cru que o estado possui, isso sendo combinado às medidas governamentais contemporâneas, implementadas. No entanto, mesmo com grande demanda por seu consumo, o QMA em sua história pregressa podia ser fabricado sem a adoção de boas práticas de fabricação, culminando em riscos à saúde, sendo o seu comércio limitado à informalidade (2). Deste modo, os queijos de produção artesanal, poderão ter em sua composição microrganismos indesejáveis que habitam as pastagens, o solo, a água, o ambiente, a estrutura e utensílios, envolvidos no processo produtivo, se tornando fontes potenciais de contaminação e contribuindo negativamente no desenvolvimento das características típicas e desejadas estabelecidas pela microbiota selvagem sobre o produto (3).

Entre os principais microrganismos contaminantes está o comensal à animais de sangue quente, habitualmente presente na pele, glândulas e mucosas dos humanos, o Staphylococcus aureus, pertencente ao gênero estafilococos e do grupo dos estafilococos coagulase positivo. Dentre as espécies produtoras da enzima coagulase, S. aureus subsp. aureus é o patógeno mais comum e os componentes deste grupo são considerados patógenos potencialmente sérios, pois há relação direta a serem cepas produtoras de enterotoxinas (4). Um patógeno com essas características é facilmente encontrado em um rebanho cuja as matrizes não possuam adequado controle zoonótico, já que também é o agente etiológico da mastite infecciosa, como pode ser transferido ao alimento pelos manipuladores, em possíveis falhas das boas práticas de fabricação no decorrer do processo de produção (5,6).

Trata-se de uma bactéria Gram positiva, anaeróbios facultativos, catalase positivo, sua temperatura ótima de crescimento é de 35-40 °C, coerente com a temperatura de obtenção do leite logo após a ordenha e com a temperatura do ambiente de maturação a que os queijos artesanais são submetidos. Crescem em ampla faixa pH, de 4,2-9,3, não sendo as condições da matriz alimentar desfavoráveis para o seu desenvolvimento. É prevalente nas vias nasais, garganta, pele e cabelos de humanos saudáveis. O úbere de vacas leiteiras, se infectados, tornam-se uma fonte de contaminante para o leite, assim como a não assepsia adequada das mãos ou ausência da utilização de luvas, em caso de lesões cutâneas, são formas que favorecem a contaminação de alimentos por esses microrganismos ao longo do processo de manipulação (5,6,4).

Ainda nos primórdios, a produção de queijo era adotada como forma de conservação do leite, que passou a ser obtido a partir da inserção da prática pecuária no decorrer das expedições do ciclo do ouro no estado. De forma inovadora entre os demais estados brasileiros, buscando fortalecer a imagem do produto, a Assembleia Legislativa mineira se empenhou na criação de um regulamento que valorizasse o alimento em seu contexto histórico e o incluíssem entre os mais apreciados queijos do mundo. Assim, foi criado o Programa Queijo Minas Artesanal em uma parceria do governo estadual e a Emater, almejando alcançar o desenvolvimento econômico das microrregiões produtoras e preservando o tradicionalismo (7, 8, 2).

Além disso, no tanger do estado de Minas Gerais, o QMA é considerado um patrimônio cultural imaterial estadual pelo Instituto Estadual do Patrimônio Histórico e Artístico de Minas Gerais (IEPHA/MG) e brasileiro, pelo Instituto do Patrimônio Histórico e Artístico Nacional (IPHAN). É um produto que sobreviveu às pressões da modernização dos processos produtivos, não só pelo apego às tradições, mas também pelo distanciamento das propriedades rurais que o produziam em relação às cidades, estando dispersas entre vales e montanhas do estado (9,10).

Atualmente, de modo pioneiro e inovador para que se alcance a desburocratização e fomente a produção de um número maior de produtores, Minas Gerais promulgou uma Lei que descreve os objetivos da Política Pública para queijos artesanais, a Política Estadual do Queijo Minas Legal. Dentre os objetivos da Política Pública, há destaque para uma parte muito significativa que é promover a adoção das boas práticas agropecuárias e de fabricação. Assim, o estado de Minas Gerais estará seguindo de forma eficiente para a valorização do produto mineiro, da cultural ancestral e dos padrões de qualidades tão pertinentes e exigidos pelo mercado e consumidores (11). Neste sentido, o objetivo do trabalho foi realizar a análise de um dos parâmetros microbiológicos exigidos pela legislação do QMA, produzido em duas propriedades da microrregião do Campo das Vertentes, sendo as coletas de amostras de queijos realizadas em duas sazonalidades, verificando suas características de qualidade no que tange a esteaspecto.

MATERIAL E MÉTODOS

SELEÇÃO DAS INSTALAÇÕES DE FABRICAÇÃO DE QUEIJO

Foram escolhidas 2 unidades produtoras de queijo minas artesanal, cadastradas junto ao Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA), com registro do selo arte, da região do Campo das Vertentes do Estado de Minas Gerais, nas cidades de Coronel Xavier Chaves (21°02’28.6″S 44°11’39.6″W), identificada neste trabalho como “Produtor M” e uma em São João Del Rey (21°05’08.5″S 44°14’26.7″W), identificada no estudo como “Produtor G”.

COLETA DAS AMOSTRAS

As queijarias selecionadas foram submetidas à amostragem em dois diferentes pontos, sendo eles:

• 1.1 Queijo no primeiro dia de fabricação, após a desenformagem, identificado nestetrabalho como queijo fresco ou queijo do tempo zero;

• 1.2 Queijo curado na própria queijaria (22 dias de maturação), identificado neste trabalhocomo queijo maturado ou queijo do tempo 22.

As análises foram realizadas separadamente, tanto na casca, quanto no centro dos queijos coletados, de ambas as propriedades e sazonalidades.

O material para análise, de cada uma das 2 unidades cadastradas da região do Campo das Vertentes, foi coletado em duas datas, sendo um dia no período de chuva/verão de 2023 e outro dia no período de seca/inverno, do mesmo ano. Os procedimentos de coleta de amostras foram semelhantes em ambas as queijarias, sendo as amostras das unidades de queijo, coletadas em condições assépticas e transferidas para sacos estéreis e transportadas, em recipiente térmico, para o Laboratório de Microbiologia dos Alimentos, no Departamento de Ciência dos Alimentos, da Universidade Federal de Lavras.

PREPARO DE SOLUÇÕES PARA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA

O preparo das suspensões para análise microbiológica dos queijos frescos e maturados, foi realizado conforme descrito por Pereira (12). 25 g de QMA foram adicionados em 225 ml de solução de citrato de sódio (2% m/v), estéril, sendo homogeneizados em aparelho Stomacher Metroterm® (490 golpes/ min.) por 5 minutos. Em seguida foram realizadas diluições seriadas em água peptonada (0,1% m/v).

ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVO

Alíquotas de 0,1 ml das diluições adequadas das amostras de queijo maturado e da suspensões das tábuas de maturação, foram transferidas para o ágar Baird Parker e incubadas a 37 °C por 48 h. Colônias típicas e atípicas foram quantificadas, e quando presente, cerca de 5 colônias típicas foram transferidas para o caldo infusão cérebro coração (BHI) e incubadas a 37 °C por 24 h. Após esse período, alíquotas de 0,2 ml de cada cultura foram transferidas para tubos de ensaio contendo 0,5 ml de plasma de coelho-EDTA e incubados a 37 °C por 6 h. De acordo com a formação de coágulo os isolados foram classificados com 1+; 2+; 3+ e 4+. Apenas os isolados 3+ e 4+ foram considerados estafilococos coagulase positiva (4). Esses isolados foram identificados por MALDI-TOF MS.

IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS POR MALDI-TOF MS

Os isolados bacterianos, coletados após as análises microbiológicas dos pontos amostrais, foram submetidos a identificação pela análise do perfil proteico, seguindo o protocolo de extração padrão, com adaptações (13).

Para a análise, aproximadamente uma alçada de cultura bacteriana foi ressuspendida em 0,3 ml de água deionizada ou Miliq, homogeneizada em aparelho tipo Vortex por 30 segundos, após foi adicionada uma solução de etanol 95%, homogeneizada em aparelho tipo Vortex por 30 segundos, centrifugada por 2 minutos a 13.000 RPM, seguido pelo descarte do sobrenadante do eppendorf, com retirada do seu excesso de umidade com papel, seguido pela adição de 50 μl de ácido fórmico 70% ao pellet formado, homogeneização em aparelho tipo Vortex por 30 segundos e adição de 50 μl de acetronitrila, homogeneização em aparelho tipo Vortex por 30 segundos, encerrando com centrifugação do eppendorf por 2 minutos a 13.000 RPM.

No momento da análise, uma segunda centrifugação foi realizada e logo após, 0,1μl dos precipitados obtidos contendo as células lisadas, foram depositados em placa de 96 poços e secas em temperatura ambiente para análise por espectrometria de massa de tempo de voo de Dessorção/Ionização a laser Assistida por Matrix, Maldi-tof Microflex LT (Bruker Daltonics®, Bremen, Alemanha) e análise dos dados no software Flex Control (Versão 3.0).

Os isolados foram analisados em triplicata e a metodologia de calibração do equipamento e método de análise de dados foram realizados conforme descrito por Carvalho et al. (13) A identificação dos resultados foi expressada por BioTyper ™ log (scores), indicando a similaridade da cepa desconhecida com o perfil disponível em bancos de dados do MALDI-TOF MS. Para a interpretação dos resultados, os pontos de corte recomendados pelo fabricante foram utilizados para determinar identificaçãosegura ao nível de gênero e espécie (≥ 2.000), identificação provável ao nível de gênero (1.700 a 1.999).

ANÁLISES ESTATÍSTICAS

O delineamento inteiramente casualizado (DIC) em esquema fatorial foi utilizado dos quais os fatores eram: 2 estações do ano (verão e inverno) x 2 produtores de QMA registrados junto ao IMA (G: Guatambu/ São João del Rey e M: Muiracatiara/ Coronel Xavier Chaves) x 2 tempos de coleta do material (0 e 22 dias), para avaliar as análises microbiológicas. Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão, o qual foi aplicada análise de variância (ANOVA) para os parâmetros, seguido de T-Student (p< 0.05). Todas as análises estatísticas foram realizadas no software R (4.0.2, pacotes FactoMineR e Factoextra).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

ANÁLISE MICROBIOLÓGICA E DE QUALIDADE

A contagem da população microbiana das cascas e centros dos queijos, encontramse na Tabela 1. A análise microbiológica por métodos dependentes de cultivo, foi realizada a fim de determinar a qualidade dos queijos analisados, com base nos parâmetros estipulados pela legislação estadual vigente e específica para o Queijo Minas Artesanal (14).

Estafilococos coagulase positivo podem estar em um limite máximo de 1 x 103 UFC/g, segundo os parâmetros microbiológicos aceitáveis da legislação. Nas amostras de queijo do tempo zero, de ambas as estações e de ambos os produtores, não houve confirmação de colônias. No entanto, os queijos maturados dos dois produtores, na região central dos queijos, apresentaram contagens do microrganismo no inverno, mas sem diferença significativa em virtude da sazonalidade. A contagem do centro do queijo produtor M, para essa classe de microrganismos, foi em número inferior ao reprovado pela legislação (2,4 x 102 UFC/g) e do produtor G logo acima do máximo permitido, 1,4 x 103 UFC/g, mas sem diferença significativa entre produtores. No verão, a contagem média destas amostras centrais do produtor M, também podem ser consideradas reprovadas, segundo a legislação, por constituírem 3,5 x103 UFC/g de estafilococos coagulase positivo.

Relatos semelhantes foram demonstrados por Castro et al. (15) em seu estudo, no qual obtiveram contagem de estafilococos coagulase positivo de 3,77 log UFC/g em queijos minas artesanal do Triângulo Mineiro maturados por 21 dias, no verão. Castro (16) também verificou, quanto a avaliação da qualidade microbiológica de queijos frescos do Campo das vertentes, cerca de 3 log UFC/g no verão nas contagens de estafilococos coagulase positiva e cerca de 6 log UFC/g no inverno.

A presença de Staphylococcus aureus é um dos problemas relacionados ao consumo de queijos artesanais produzidos a partir do leite cru, já que a matéria prima pode veicular este patógeno. Não foi o caso deste estudo, mas Staphylococcus spp. em população superior a 104 UFC/g desencadeia a probabilidade de produção de enterotoxinas nos alimentos, o que é um palpável risco ao consumidor (17,18). Staphylococcus aureus prevalente em leite e derivados é um indicador de falhas higiênicas no processamento emanipulação do produto ou um possível indicador de mastite contagiosa no rebanho, já que este microrganismo é um dos agentes causadores no gado leiteiro. A ocorrência de padrões microbiológicos distintos é esperada entre produtos artesanais, por isso houve diferenças entre os produtores M e G, uma vez que esta variação está condicionada ao treinamento e prática dos manipuladores de alimento e a adoção das Boas Práticas de Fabricação (BPF) em cada uma das propriedades (5, 6, 19).

IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS POR MALDI-TOF MS

No que tange a população de estafilococos coagulase positivo, mesmo que o plaqueamento e os testes subsequentes de coagulase, não tenham levado a confirmação, pelo MALDI-TOF, isolados de S. aureus foram identificados, além das amostras dos queijos maturados citados anteriormente. Foram confirmados isolados de S. aureus nas amostras dos queijos frescos e maturados do produtor M, tanto no inverno quanto no verão, tanto na casca quanto no centro do queijo, o que demonstra a importância da combinação entre técnicas dependentes e independentes de cultivo para a identificação de microrganismos, mesmo que haja relatos de que patógenos potenciais como S. aureus possam ser contidos no decorrer da maturação (16).

Nas amostras do produtor G, a análise do perfil proteico levou a confirmação de outras espécies do gênero estafilococos coagulase negativo, em ambas as sazonalidades e nas diferentes partes do queijo sendo eles, S. simulans, S. saprophyticus, S. haemolyticus e S. xylosus. S. saprophyticus e S. xylosus também faziam parte das colônias atípicas com crescimento e identificadas após o plaqueamento das amostras de queijos do produtor M. Esses resultados corroboram com os achados de Brito et al. (20) cujos os microrganismos relativamente mais identificado entre seus isolados foi S. aureus, seguido por estafilococos coagulase negativo.

O mesmo foi observado por Almeida et al. (21), cujo os agentes com maior índice de isolamento em suas amostras de leite de vaca, pertencia ao gênero Staphylococcus spp., gênero que se evidencia por sua relevante frequência nos casos clínicos e subclínicos de mastite nos bovinos, estando assim presentes nos derivados de leite, uma vez que esta espécie está também presente na microbiota gastrointestinal dos animais e estarem relacionados a casos de surtos alimentares e até mesmo na produção de enterotoxinas em alimentos (22, 23). A doença ocasionada por este patógeno pode ser autolimitada, de curta duração e sem ameaças de morte, sendo a mais comum das doenças veiculadas por alimentos (4, 5, 6).

CONCLUSÕES

A confirmação da presença prevalente de Staphylococcus aureus nas amostras, vai de encontro com o indicador de falhas higiênicas, o que pode ser de grande importância para o serviço de saúde pública, já que S. aureus é um patógeno de origem alimentar, exigindo medidas de controle.

A matéria prima também é uma das fontes habituais de contaminação dos queijos artesanais, uma vez que o tradicionalismo do seu modo de fazer não permite a pasteurização do leite e o úbere das vacas leiteiras podem estar infectados, tanto com os agentes causadores da mastite clínica quanto da subclínica, conforme confirmado neste trabalho, havendo a necessidade de controle sanitário do rebanho e separação da ordenha das matrizes, caso estejam infectadas, até que cesse o seu tratamento.

O fato das amostras de ambos os produtores terem apresentado o patógeno por método independente de cultivo e estarem com a contagem populacional destes microrganismos acima do exigido pela legislação, cada produtor em uma determinada sazonalidade, o produtor G com suas amostras reprovadas no inverno e o produtor M no verão, demonstram que é necessário maior atenção a assepsia das mãos, utensílios e equipamentos envolvidos na produção dos queijos, bem como, utilização de luvas em caso dos manipuladores apresentarem algum tipo de lesão cutânea superficial, atualização dos procedimentos de boas práticas de ordenha e fabricação, para que ao longo de todo o processo de fabricação, seja minimizada as possibilidades de contaminação e se obtenha tanto matéria prima, quanto um produto com qualidade microbiológica.

Nesse sentido, as ações extensionistas realizadas entre entidades de extensão estaduais, como a EPAMIG, instituições de ensino e produtores artesanais, são um modelo inicial e promissor de ação para atualização e treinamentos rotineiros para o agronegócio artesanal.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Universidade Federal de Lavras (UFLA), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas-Gerais (FAPEMIG) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

REFERÊNCIAS

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