VALORIZAÇÃO DE SEMENTES DE INGÁ (Inga laurina Willd) PELO USO DE TECNOLOGIA SUSTENTÁVEL PARA A EXTRAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS

Este capítulo faz parte da coletânea de trabalhos apresentados na VII Semana de Alimentos (Semal), publicado no livro: Avanços e Pesquisas em Ciência dos Alimentos: Novas Tendências e Aplicações. – Acesse ele aqui.

DOI: 10.53934/agronfy-2025-03-36

ISBN:

Déborah Cristina Barcelos Flores Righi 1*; Anelise Pigatto Bissacotti 1;Vanessa Ramos do Nascimento 2; Cezar Augusto Bizzi 2; Naila Peil Marcuzzo 1; Andressa Inês Schú 1; Duane Soares Vieira 1; Flávia Michelon Dalla Nora

*Autor correspondente (Corresponding author) – Email: deborahbflores@gmail.com;

RESUMO

O estudo teve por objetivo valorizar as sementes de Inga laurina (Sw.) Willd por meio da otimização das condições de extração dos seus compostos bioativos fazendo-se uso da tecnologia sustentável de ultrassom, além de compará-la com o método convencional. Frutos de I. laurina Willd foram colhidos e as suas sementes separadas e submetidas à pré- secagem, moagem, peneiramento e acondicionamento. Em seguida, realizou-se a extração dos compostos fenólicos, flavonoides e capacidade antioxidante por meio dos métodos de extração convencional por maceração e emergente por sonda ultrassônica a 20 kHz e 130 W, determinação e quantificação destes. Ao utilizar o método de maceração obteve-se maiores concentrações de compostos bioativos nas condições de 70 ºC, 0,5 g de amostra, 70% de etanol e 35 min, sendo iguais a 110,86 ± 2,21 mg EAG g-1 de compostos fenólicos totais, 28,75 ± 0,55 mg EQ g-1 de flavonoides totais, 43,41 ± 1,44 µmol TEAC g-1 de capacidade antioxidante e 7,02 ± 2,33 mg mL-1 para IC50. Sob as mesmas condições ótimas de extração por maceração, porém durante 15 min, obteve-se as maiores concentrações de bioativos por sonda ultrassônica, sendo estas iguais a 140,21 ± 0,05 mg EAG g-1, 46,12 ± 1,53 mg EQ g-1, 63,05 ± 2,90 µmol TEAC g-1 e 3,74 ± 0,94 mg mL-1 para compostos fenólicos, flavonoides totais, capacidade antioxidante e IC50, respectivamente. A sonda ultrassônica, em comparação com o método convencional, demonstrou ser eficiente na extração de compostos bioativos das sementes de I. laurina.

Palavras-chave: atividade antioxidante; compostos fenólicos; extração assistida por ultrassom; extração convencional; método de extração sustentável e emergente

INTRODUÇÃO

O Inga laurina (Sw.) Willd é uma planta tropical arbórea integrante da subfamília Mimosoideae das Leguminoseae, amplamente distribuída nas Américas Central e do Sul (1). Popularmente conhecido como ingá branco (1) ou ingá-mirim, o I. laurina caracterizase por apresentar frutos constituídos por 41% de polpa, 39% de casca e 20% de semente (2), com coloração variando entre verde a marrom conforme o estádio de maturação (3).

Em se tratando das sementes do I. laurina, fração não convencionalmente consumida, esta possui alto teor energético e de cinzas, proteínas e carboidratos, quandocomparada a composição da casca e polpa (4). Já em relação aos constituintes fitoquímicos, poucos estudos têm explorado tal aspecto nas sementes de I. laurina, porém foi evidenciado que representa uma importante fonte de compostos fenólicos (5,6), assim como outras espécies do fruto, nas quais também há variados antioxidantes (7-11).

Os compostos fenólicos são substâncias amplamente encontradas em vegetais e caracterizam-se por apresentarem em sua estrutura química um ou mais grupos fenólicos, ou seja, um anel de benzeno com um ou mais grupos hidroxila ligados a ele (12). Ao serem consumidos, os compostos fenólicos promovem diversos benefícios ao organismo humano, em virtude de possuírem ação antioxidante, responsável por proteger as células do corpo da atuação de radicais livres, e anti-inflamatória (12), além de exercerem efeito anticancerígeno, antimutagênico, antialérgico e antienvelhecimento (13).

Dentre os compostos fenólicos estão os flavonoides, os quais são promotores de saúde, prevenindo o desenvolvimento de doenças crônicas (14). Estudos de revisão permitiram identificar que os flavonoides apresentam potencial terapêutico e preventivo quanto às doenças cardiovasculares, neurodegeneração, diabetes, inflamação, distúrbios autoimunes e câncer (14,15). Por isso, a ingestão diária de fontes de flavonoides é recomendada.

Diante do contexto exposto, o interesse em extrair compostos fenólicos e flavonoides de alimentos aumentou, assim como o de superar as limitações dos métodos de extração convencionais, por meio de estratégias mais sustentáveis. Conforme Waseem et al. (16), a extração de compostos bioativos de alimentos não deve comprometer a sustentabilidade.

As técnicas de extração convencionais como, por exemplo, a maceração, são desvantajosas, pois demandam de maior quantidade de solventes, que por sua vez podem ser perigosos; prolongado tempo de extração e baixa seletividade e rendimento de extração (13). Em contrapartida, os métodos não convencionais são ecologicamente corretos, necessitando de menos produtos químicos sintéticos e orgânicos e tempo operacional, além de possibilitarem melhor rendimento e qualidade do extrato (17,18).

Nesse sentido, a extração assistida por ultrassom tem sido considerada uma das mais promissoras técnicas de extração emergentes (17). O ultrassom é resultante de ondas sonoras com faixa de frequência entre 20 kHz e 100 MHz, sendo inaudível pelo ser humano (17). As ondas de ultrassom são geradas por transdutores que convertem energia elétrica ou mecânica em sonora por meio de vibrações mecânicas (19), que se propagam em ciclos alternados de compressão e expansão, resultando na produção, crescimento e colapso de bolhas, fenômeno denominado de cavitação (17), através do qual se dá a extração dos compostos de interesse dos alimentos. Assim, a extração por ultrassom é um método verde, acessível, simples e rápido, permitindo a obtenção de componentes termolábeis (13).Entre os modelos de equipamentos de emissão de ultrassom, a sonda é a preferida (20), visto que é considerada mais potente, por haver menor dispersão de energia, assim como, se adequa à substratos com volumes menores (19).

Dessa forma, o presente estudo teve por objetivo valorizar as sementes de Inga laurina (Sw.) Willd por meio da otimização das condições de extração dos seus compostos bioativos fazendo-se uso da tecnologia sustentável de ultrassom, além de compará-la com o método convencional.

MATERIAL E MÉTODOS

MATÉRIA-PRIMA

Entre março a junho de 2023, frutos de I. laurina (figura 1) foram colhidos no Campus da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) em Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasil. Os frutos foram levados ao Núcleo Integrado de Desenvolvimento e Análises Laboratoriais (Nidal) da UFSM para seleção, abertura e retirada das sementes.

As sementes foram submetidas à pré-secagem conforme a metodologia descrita por Flores et al. (21), à 45 ± 5 °C por 48 h em estufa de circulação de ar forçada (Marconi, MA-035/100, Piracicaba, Brasil), seguida da moagem em moinho de facas (marca Willy, modelo SL-31), peneiramento a 20 mesh (Figura 2), acondicionamento em recipiente vedado e mantidas ao abrigo da luz em freezer (-18 °C) até o momento das análises.

MÉTODOS DE EXTRAÇÃO

Extração convencional por maceração

A extração convencional por maceração (Figura 3) foi realizada conforme Flores et al. (21). Os extratos da semente do I. laurina foram preparados a partir das amostras previamente secas e moídas, utilizando solvente hidroalcoólico, e empregando-se um agitador magnético com aquecimento (WEALAB WEA – AA1030B).

Para a obtenção da melhor condição de extração dos compostos fenólicos, flavonoides e capacidade antioxidante, realizou-se testes variando o tempo (5, 15, 25 e 35 min), a temperatura (25, 40, 55 e 70 ºC), o peso de amostra (0,5; 2; 3,5 e 5 g) e a concentração de etanol (30, 50, 70 e 90%), partindo-se de resultados preliminares para a condição fixa de extração 15 min, 70 ºC, 0,5 g de amostra e 70% de etanol. Por fim, cada extrato foi submetido a centrifugação (SH 120 – Centrilab, Brasil) a 3000 rpm por 15 min, filtrado e armazenado ao abrigo da luz à -18 °C.

Extração emergente por sonda ultrassônica

A extração por sonda ultrassônica (VC-130; Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT, EUA) operando a 20 kHz e com potência nominal de 130 W (Figura 4) ocorreu conforme metodologia descrita por Flores et al. (21).

Os extratos das sementes de Ingá foram preparados a partir das amostras previamente secas e moídas e, em seguida, avaliou-se os parâmetros de extração conforme as mesmas condições de tempo, temperatura, massa de amostra e concentrações de etanol utilizadas no método de maceração. Por fim, os extratos foram submetidos a centrifugação (SH 120- Centrilab, Brasil) a 3000 rpm por 15 min, filtrados e armazenados ao abrigo da luz à -18 °C.

DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS

Conteúdo de compostos fenólicos totais

Para a determinação do conteúdo de fenólicos totais foi utilizado o método espectrofotométrico Folin-Ciocalteu (22) modificado por Roesler et al. (23). Já a quantificação de compostos fenólicos totais se deu a partir da elaboração de uma curva de calibração e a absorbância do extrato foi comparada com uma curva padrão de ácido gálico. A concentração do teor de fenólicos totais foi expressa em miligramas equivalente de ácido gálico por grama de amostra seca (mg EAG g-1).

Conteúdo de flavonoides total

Para a determinação do conteúdo total de flavonoides foi utilizado o ensaio colorimétrico proposto por Zhishen, Mengcheng e Jianming (24). Realizou-se as leituras com a absorbância a 510 nm em espectrofotômetro (Biospectro, modelo: SP – 220), elaborou-se a curva de calibração e a absorbância do extrato foi comparada com uma curva padrão de quercetina. Por fim, o teor total de flavonoides foi expresso em mg equivalente de quercetina por grama de amostra seca (mg EQ g-1).

Determinação da capacidade antioxidante

A atividade antioxidante foi determinada pela capacidade de eliminar radicais dos extratos em relação ao radical 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH) (25). A capacidade de sequestrar radical livre foi calculada conforme a equação: %DPHHradicalscavenging = [(A0 – As) ÷ A0] x 100, onde A0 representa a absorbância controle e As corresponde a absorbância da amostra, sendo expressa como percentual de inibição de oxidação do radical. A atividade de eliminação foi medida através da diminuição da absorbância das amostras em comparação com o padrão DPPH.

O valor de IC50 foi determinado pela equação da reta plotada através dos resultados contendo os valores de concentração (mg mL-1) utilizados no eixo X e os percentuais de proteção encontrados no eixo Y. Além disso, foi construída uma curva padrão de Trolox em µmol versus percentual de inibição, sendo o resultado expresso em µmol equivalentes de Trolox/g de amostra seca (µmol TEAC g-1).

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados apresentados como médias e desvio-padrão. As médias foram submetidas à análise de variância (ANOVA) e, quando observada diferença significativa, realizou-se a comparação destas pelo teste de Tukey, com nível de significância de 5% (p<0,05), através do programa estatístico Statistica® 10.0 (Stat Soft, Inc., EUA).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Após a realização da extração de compostos fenólicos de sementes de I. laurina por meio do método convencional de maceração, empregando-se diferentes tempos, temperaturas, peso de amostra e concentrações de etanol, verificou-se que as maiores concentrações foram obtidas sob as condições de 35 min (100,33 ± 4,41 mg EAG g-1), 70 ºC (88,11 ± 0,96 mg EAG g-1), 0,5 g de amostra (85,33 ± 3,33 mg EAG g-1) e 70% de etanol (83,67 ± 1,67 mg EAG g-1) (Tabela 1). Sob estas mesmas condições ótimas de extração de compostos fenólicos obteve-se as maiores concentrações de flavonoides totais; contudo, houve maior extração destas substâncias quando utilizado o máximo teor de álcool (90%).

Em extrações de compostos fenólicos, flavonoides e antioxidantes, o solvente exerce papel fundamental, o que é confirmado no estudo conduzido por Martins et al. (26). Ao utilizarem hexano para a obtenção de extratos de I. laurina submetidos ao método convencional, os autores constataram teores iguais a 35,0 ± 0,1 mg EAG-1 e 33,6 ± 2,1 mg EQ-1 para fenólicos totais e flavonoides, respectivamente. Em contrapartida, os teores de compostos fenólicos totais (127,7 ± 0,1 mg EAG-1) e flavonoides totais (133,1 ± 3,5 mg EQ-1) foram maiores quando realizada a extração por método convencional com solução hidroetanólica de 95% durante 48 h. Diante dos resultados de Martins et al. (26), evidenciase o alto poder de extração que o etanol apresenta, quando comparado a outros solventes. Além disso, o etanol é classificado como um solvente ambientalmente correto, pois é originado a partir de fontes renováveis, de baixo custo e não tóxicas, podendo ser utilizado em sistemas alimentares (27,28).

No que diz respeito à temperatura, esta é um fator importante para a extração de compostos fenólicos. Arina e Harisun (29), ao testarem a faixa de temperatura de 50 °C a 100 °C para a obtenção de extratos de Quercus infectoriae, verificaram maior quantidade de ácido tânico e atividade antioxidante a 75 °C. Tal resultado deve-se ao fato de que a viscosidade do solvente diminui em temperaturas mais altas, permitindo que mais compostos ativos sejam solubilizados.

Além do solvente e da temperatura, outros fatores são importantes durante a extração, sendo estes: o tempo e o peso da amostra. Assim, quanto maior o tempo e menor a quantidade de amostra, em geral, maiores são as concentrações de compostos bioativos obtidos (30).

Em se tratando da atividade antioxidante e capacidade de inibição (IC50), estes parâmetros não diferiram das condições ótimas de extração identificadas para os compostos fenólicos totais e flavonoides totais, sendo as melhores condições observadas a 35 min, 70 ºC, 0,5 g de amostra e 70% de etanol, conforme pode ser observado na tabela 1. Salienta-se que o IC50 consiste na menor concentração de antioxidante necessária para inibir 50% da atividade dos radicais livres; por isso, quanto menor o valor de IC50, mais potente é o antioxidante (31).

Ao utilizar o método sustentável de extração por sonda ultrassônica para a obtenção dos compostos fenólicos totais, constatou-se que as melhores condições são semelhantes daquelas identificadas para a maceração, diferindo apenas quanto ao tempo, o qual foi menor, apenas 15 min (Figura 5). A aplicação de ultrassom durante 15 min, além de permitir obter as maiores concentrações de compostos fenólicos totais, resultou em maiores extrações dos demais compostos bioativos em estudo (Tabela 2).

A maior eficiência da sonda em menos tempo se deve a intensidade do ultrassom ser transmitido na ponta deste equipamento, gerando maiores densidades de potência, o que é chamado de ultrassom de alta potência ou disruptor de célula (>100 W/L). Desta forma, o ultrassom promove rápida ruptura das paredes celulares de amostras sólidas, possibilitando que o solvente atue imediatamente e, consequentemente, a taxa de transferência de massa seja maior (32). No entanto, Vinatoru (32) alerta para o fato de que a exposição prolongada de compostos fenólicos à sonicação causa a destruição das suas estruturas, o que, por sua vez, resulta em menor eficiência da extração. Por isso, estudos com o objetivo de avaliar as condições de extração de compostos bioativos são relevantes.

Após a quantificação das concentrações dos compostos bioativos extraídos por meio dos métodos convencional e emergente, foram realizadas novamente as extrações conforme as condições ótimas identificadas.

Para a extração convencional as melhores condições haviam sido de 35 min, 70 ºC, 0,5 g de amostra e 70% de etanol. Sob tais condições, foram obtidos 110,86 ± 2,21 mg EAG g-1 de compostos fenólicos totais, 28,75 ± 0,55 mg EQ g-1 de flavonoides totais, 43,41 ± 1,44 µmol TEAC g-1 de capacidade antioxidante e 7,02 ± 2,33 mg mL-1 para IC50 (Figura 6). Já ao empregar a sonda ultrassônica sob as mesmas condições da extração por maceração, porém por 15 min, verificou-se as concentrações de 140,21 ± 0,05 mg EAG g-1 de compostos fenólicos totais, 46,12 ± 1,53 mg EQ g-1 de flavonoides totais, 63,05 ± 2,90 µmol TEAC g-1 e 3,74 ± 0,94 mg mL-1 para IC50.

Assim, a sonda ultrassônica foi o método que permitiu maiores extrações de compostos bioativos em sementes de Ingá, em menos tempo e com maior rendimento. Dentre os aspectos que contribuem para que o ultrassom apresente maior eficiência de extração é o fenômeno de cavitação acústica. A energia liberada pelo colapso das bolhas de cavitação contribui para a desorganização do tecido vegetal, facilitando a extração de compostos fenólicos. A migração dos compostos bioativos para o solvente ocorre por meio de difusão e/ou dissolução, processo intensificado pela ação do ultrassom (33). Por isso, as vantagens do uso da sonda ultrassônica abrangem a alta reprodutibilidade, maior pureza do produto final, menor tempo de extração, segurança, rapidez, versatilidade, natureza ecologicamente correta, baixo uso de solventes, maiores rendimentos dos compostos bioativos, alta potência para extrair os compostos termolábeis e baixo investimento (34).

CONCLUSÕES

A sonda ultrassônica, em comparação com o método convencional, demonstrou ser eficiente na extração de compostos fenólicos totais, flavonoides totais e compostos antioxidantes de sementes de I. laurina. Apesar dos métodos de extração convencional e por sonda terem apresentado as mesmas condições ótimas para a obtenção das maiores concentrações de compostos bioativos, este último destaca-se por ocorrer em menor tempo.

As condições ótimas de extração de compostos bioativos de sementes de I. laurina por sonda ultrassônica foram em 15 min, 70 ºC, 0,5 g de amostra e 70% de etanol. Assim, além de ser considerada sustentável, a extração por sonda ultrassônica é um método eficiente. Além disso, o extrato de sementes de I. laurina mostrou ser uma fonte natural de bioativos, com alto potencial antioxidante.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Finanças Código 001 pelo financiamento deste estudo, assim como aos laboratórios de pesquisa da Universidade Federal de Santa Maria envolvidos neste trabalho.

REFERÊNCIAS

1. Macedo MLR, Garcia VA, Freire MGM, Richardson M. Characterization of a Kunitztrypsin inhibitor with a single disulfide bridge from seeds of Inga laurina (SW.) Willd.Phytochem. 2007;68(8):1104-1111.

2. Oliveira CES, Zuffo AM, Fonseca WL, Steiner F. Physical characterization of fruitsand seeds Inga laurina (Sw.) Willd. (Fabaceae – Mimosaceae). Rev Agric Neotrop.2019;6(3):105-111.

3. Schulz DG, Oro P, Volkweis C, Malavasi MM, Malavasi UC. Maturidade Fisiológicae Morfometria de Sementes de Inga laurina (Sw.) Willd. Floresta Ambient.2014;21(1):45-51.

4. Martins AM, Malafaia CRA, Nunes RM, Macenas AS, Moura PHB, Muzitano MF,Machado TB, Carneiro CS, Leal ICR. Nutritional, chemical and functional potential ofInga laurina (Fabaceae): A barely used edible species. Food Res Int.2024;178:113751.

5. Araújo, NAV. Embriologia, Apomixia e Poliembrionia em Inga laurina (Sw.) Willd(Fabaceae Mimosoideae) [Dissertação de Mestrado]. Uberlândia: UniversidadeFederal de Uberlândia; 2015.

6. Lima MC, Portari GV. Centesimal composition and antioxidant compounds of twofruits from the Cerrado (Brazilian Savannah). Rev Ceres. 2019;66(1):41-44.

7. Flores DCB, Boeira CP, Lucas BN, Alves JS, Piovesan N, Vieira VB, Soquetta MB,Rosa JR, Weis GCC, Rosa CS. Extração de compostos bioativos por ultrassom dassementes de ingá (Inga marginata Willd). In: Vieira VB, Piovesan N, organizadoras.Avanços e Desafios da Nutrição 4. Ponta Grossa, PR: Atena Editora, 2019. p. 75-86.

8. Flores DCB, Boeira CP, Roim CMB, Librelotto DRN, Reis FL, Morandini LMB,Morel AF, Rosa CS. Phenolic compounds, antimicrobial activity, cytotoxicity andidentification of phytochemicals present in Inga marginata Willd seeds. Ci. e Nat.2021;43:e78.9. Lima NM, Falcoski TOR, Silveira RS, Ramos RR, Andrade TJASA, Costa PI, LaPorta FA, Almeida MVA. Inga edulis fruits: a new source of bioactive anthocyanins.Nat Prod Res. 2020;34(19):2832-2836.

10. Polese AAV. Composição química e atividade quimiopreventiva de câncer de frutos de Inga edulis Martius [Dissertação de Mestrado]. Vila Velha: Universidade Vila Velha; 2019.

11. Silva EM, Souza JNS, Rogez H, Rees JF, Larondelle Y. Antioxidant activities andpolyphenolic contents of fifteen selected plant species from the Amazonian region.Food Chem. 2007;101(3):1012-1018.

12. Martins LSR, Silva SA, Silva OLL. Cartilha de Alimentos Funcionais: A Ciência no seu Prato: Compostos Fenólico e Flavonoides: Volume 2. Belém: Universidade Federal Rural da Amazônia, 2024.

13. Pagano I, Campone L, Celano R, Piccinelli AL, Rastrelli L. Green non-conventionaltechniques for the extraction of polyphenols from agricultural food by-products: Areview. J Chromatogr A. 2021;1651:462295.

14. Shen N, Wang T, Gan Q, Liu S, Wang L, Jin B. Plant flavonoids: Classification,distribution, biosynthesis, and antioxidant activity. Food Chem. 2022;383:132531.

15. Yuan D, Guo Y, Pu F, Yang C, Xiao X, Du H, He J, Lu S. Opportunities andchallenges in enhancing the bioavailability and bioactivity of dietary flavonoids: Anovel delivery system perspective. Food Chem. 2024;430:137115.

16. Waseem M, Majeed Y, Nadeem T, Naqvi LH, Khalid MA, Sajjad MM, Sultan M,Khan MU, Khayrullin M, Shariati MA, Lorenzo JM. Conventional and advancedextraction methods of some bioactive compounds with health benefits of food andplant waste: A comprehensive review. Food Front. 2023;4(4):1681-1701.

17. Azmir J, Zaidul ISM, Rahman MM, Sharif KM, Mohamed A, Sahena F, Jahurul MHA,Ghafoor K, Norulaini NAN, Omar AKM. Techniques for extraction of bioactivecompounds from plant materials: A review. J Food Eng. 2013;117(4):426-436.

18. Jha AK, Sit N. Extraction of bioactive compounds from plant materials using combination of various novel methods: A review. Trends Food Sci Technol. 2022;119:579-591.

19. Belwal T, Chemat F, Venskutonis PR, Cravotto G, Jaiswal DK, Bhatt ID, Devkota HP,Luo Z. Recent advances in scaling-up of non-conventional extraction techniques:Learning from successes and failures. Trends Food Sci Technol. 2020;127:115895.

20. Chemat F, Rombaut N, Sicaire A-G, Meullemiestre A, Fabiano-Tixier A-S, Abert-Vian M. Ultrasound assisted extraction of food and natural products. Mechanisms, techniques, combinations, protocols and applications. A review. Ultrason Sonochem. 2017;34:540-560.

21. Flores DCB, Boeira CP, Weis, GCC, Mello RO, Reis FL, Morandini LMB, Morel AF,Santos D, Flores EMM, Záchia RA, Nogueira-Librelotto DR, Rolim CMB, Rosa CS.Extraction of antioxidant and antimicrobial compounds from Inga marginata Willdbark and pulp using different extraction techniques and phytochemicalcharacterization. Innov Food Sci Emerg Technol. 2023;83:103244.

22. Singleton VL, Rossi JA. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdicphosphotungstic acid reagents. Am J Enol Vitic. 1965;16:144-158.

23. Roesler R, Malta LG, Carrasco LC, Holanda RB, Sousa CAS, Pastore GM. Antioxidant activity of cerrado fruits. Food Sci Technol. 2007;27(1):53-60.

24. Zhishen J, Mengcheng T, Jianming W. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chem. 1999;64(4):555- 559.

25. Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Food Sci Technol. 1995;28(1):25-30.

26. Martins CM, Morais SAL, Martins MM, Cunha LCS, Silva CV, Martins CHG, Leandro LF, Oliveira A, Aquino FJT, Nascimento EA, Chang R. Chemical Composition, Antifungal, and Cytotoxicity Activities of Inga laurina (Sw.) Willd Leaves. Sci World J. 2019:1-12.

27. Aznar-Ramos MJ, Razola-Díaz, MDC,Vito Verardo, Gómez-Caravaca, AM 2022. Comparison between Ultrasonic Bath and Sonotrode Extraction of Phenolic Compounds from Mango Peel By-Products. Horticulturae, 2022: 8, 1014.

28. Tekin K, Hao, N, Karagoz S, Ragauskas A. Ethanol: A Promising Green Solvent for the Deconstruction of Lignocellulose. Chem. Eur. J. 2018. 11: 3559 – 3575.

29. Arina MZI, Harisun Y. Effect of extraction temperatures on tannin content and antioxidant activity of Quercus infectoria (Manjakani). Biocatal Agric Biotechnol. 2019;19:101104.

30. Chuo SC, Nasir HM, Mohd-Setaparum SH, Mohamed SF, Ahmad A, Wanie WA, Muddassir M, Alarifi A. Um vislumbre dos métodos de extração de compostos ativos de plantas. Crit Rev Anal Chem. 2022;52(4):667-696.

31. Alves CQ, David JM, David JP, Bahia MV, Aguiar RM. Métodos para determinação de atividade antioxidante in vitro em substratos orgânicos. Quim Nova. 2010;33(10):2202-2210.

32. Vinatoru M. An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive principles from herbs. Ultrason Sonochem. 2001;8(3):303-313.

33. Chemat F, Vian MA, Cravotto G. Green Extraction of Natural Products: Concept and Principles. Int J Mol Sci. 2012;13(7):8615-8627.

34. Chemat F, Rombaut N, Sicaire AS, Meullemiestre A, Fabiano-Tixier A-S, Abert-Vian M. Ultrasound assisted extraction of food and natural products. Mechanisms, techniques, combinations, protocols and applications. A review. Ultrason Sonochem. 2017;34:540-560.